一、前言

經(jīng)常做實驗的小伙伴都知道，從事細胞培養(yǎng)工作時都有可能面臨細胞受到污染的境況。對于細胞的受污染問題，最為緊要的在于防范，因為一旦細胞受到污染，欲挽回已十分艱難，即便成功挽回，細胞的狀態(tài)亦會受損，進而對實驗結(jié)果造成影響。因此，讓我們首先探討一下如何有效地進行預(yù)防。

生物安全柜是細胞處理的主要場所，而培養(yǎng)箱是細胞生長的主要場所，所以細胞污染通常就發(fā)生在這兩個地方。那么在使用生物安全柜和培養(yǎng)箱時如何做好預(yù)防措施呢？

二、措施

1. 所有進入安全柜的東西都要盡可能保證無菌

如果實驗室條件允許，那直接購買商品化的試劑和耗材是最穩(wěn)妥的，他們的試劑和耗材一般只要是正品都可以保證無菌。如果試劑需要自己用干粉配制，那么在配制中需要嚴(yán)格按無菌操作進行。另外每次試劑配制量不宜過多，比如wan全培養(yǎng)基建議以一到兩周內(nèi)用完為宜。

試劑在分裝時可以考慮再用針頭式過濾器過濾一次，減少污染的可能性。如果所用移液器吸頭是散裝的，則注意在將吸頭裝入吸頭盒時需要帶手套，因為滅菌時無法完quan去除吸頭上可能粘附的油脂和其他雜質(zhì)。

2. 安全柜每次使用前需要紫外照射30min滅菌

安全柜需再通風(fēng)5min以上保證換氣到位。每次處理細胞前應(yīng)將實驗需要的各種試劑、耗材備齊，盡量減少細胞處理過程中的來回走動。安全柜內(nèi)的東西盡量擺放有序，具體可以根據(jù)個人使用習(xí)慣而定，如果你使用的是公用安全柜，則可能需要使用前臨時調(diào)整。

實驗過程中所有試劑不用時需要蓋上瓶蓋，瓶蓋打開時除了干凈的吸頭，其他任何東西都不要從瓶口的上方經(jīng)過。如果使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞，則處理時不要長時間打開皿蓋。如果所用吸頭沒有濾芯，那在使用時注意不要將試劑倒吸入移液器，如果倒吸的是培養(yǎng)基，極易成為細菌生長的溫床。一把有菌的移液器可以輕松污染所有使用其處理過的細胞，所以一旦發(fā)生倒吸，要及時用酒精棉球擦去倒吸的試劑，有條件的建議使用帶濾芯的吸頭。

3. 使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞，放入培養(yǎng)箱前搖勻時要輕柔

不要將培養(yǎng)基搖到皿蓋和皿身的間隙中，這樣在細胞生長時很容易污染。如果使用瓶蓋沒有氣孔的細胞瓶培養(yǎng)細胞，放入培養(yǎng)箱前需要將瓶蓋擰松半圈左右，保證瓶內(nèi)外可以進行氣體交換，注意不要擰太松，這樣在細胞生長時也很容易污染，有條件的建議選擇瓶蓋有氣孔的細胞瓶，這樣放入培養(yǎng)箱前直接擰緊瓶蓋即可。由于培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度和濕度很高，所以最好定期用75%酒精擦拭培養(yǎng)箱消毒。培養(yǎng)箱里水槽中的水需要使用無菌水，不可以用自來水。

三、那么細胞如果還是不幸污染了又該怎么辦呢？

把細胞污染分為早期污染和晚期污染兩種情況。早期污染是細胞狀態(tài)變差，但依舊能保持生長，顯微鏡下未見明顯微生物或可見少量微生物。這種情況的話我們在換液時可以多用PBS洗幾次，然后加入適合的抗生素。早期污染只要發(fā)現(xiàn)及時，處理得當(dāng)，救回來的可能性還是很大的。

晚期污染則是細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞停止生長，顯微鏡下可見大量微生物。這時候建議大家及時清理掉相關(guān)細胞，以免污染其他細胞。在對安全柜和培養(yǎng)箱進行消毒后，再重新復(fù)蘇早批次的細胞。

細心的會發(fā)現(xiàn)，新細胞收到后，不應(yīng)急于開展實驗，而應(yīng)該先小心培養(yǎng)，凍存一到兩個批次的細胞后再開展實驗，這樣實驗過程中如果細胞出現(xiàn)問題，可以有凍存細胞保證實驗還能繼續(xù)進行。

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