1 冷凍管應(yīng)如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入 37 C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。

2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？

除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有 10-15ml 新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO  即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。

3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活。

5 何謂 FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum)  是相同的意思，兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum)  則是指小牛血清。HS (horseserum)  則是指馬血清。

6 培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用 5 %或 10% CO2？或根本沒有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中 NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的 CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升 3.7 g 時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用 10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升 1.5 g 時，則應(yīng)使用 5% CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

7 何時須更換培養(yǎng)基？

視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。

8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

9 附著性細(xì)胞繼代時所使用之 trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？

一般使用之 trypsin-EDTA 濃度為 0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20 C，避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 之活性降低，并可減少污染之機(jī)會。

10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度， 重復(fù)前述步驟即可。

11 欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為 300xg (約 1,000rpm)，5 - 10 分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

12 細(xì)胞之接種密度為何？

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。

13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

動物細(xì)胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5 - 10% DMSO (dimethyl

sulfoxide) 和 90 - 95 %原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于

DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。

14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？

冷凍保存使用之 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 之 DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 C，避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機(jī)會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 之 Nylon 材質(zhì)濾膜。

15 冷凍保存細(xì)胞之方法？

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 C 30~60 分鐘 → (-20 C 30 分鐘) → -80 C16~18 小時(或隔夜) → 氮槽 vapor phase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降 1-3 C 至–80 C  以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。*-20 C 不可超過 1 小時，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80 C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

16 細(xì)胞欲冷凍保存時，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？

細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的好方法。

18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理？ 加入相應(yīng)抗生素，直接滅菌后丟棄之。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？

不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。

20 支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)，代謝及研究任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實驗前，必須確認(rèn)細(xì)胞為 mycoplasma-free，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

        21 細(xì)胞株有支原體污染時， 該如何處理？ 

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。

22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。